Los errores en el diagnóstico de SARS-CoV-2 a través de ensayos RT-qPCR pueden llegar a ser no solo costosos sino que una pérdida de productividad para tu laboratorio, situación que no es conveniente en estos momentos de alta demanda. No obstante, si sabes cuales son los errores más comunes podrás erradicarlos oportunamente.
Sigue leyendo este artículo para conocer cuáles son y las soluciones que debes aplicar.
Presta atención a los principales errores al momento de trabajar con RT-qPCR:
El público ha puesto mucha atención en varios casos de falsos positivos de pruebas RT-qPCR para SARS-CoV-2, como ha sido el de la NFL, donde un laboratorio reportó 77 resultados falsos-positivos en un solo día y, tras investigar se dió cuenta de que las pruebas fueron realizadas en espacios pequeños donde las muestras pudieron ser contaminadas, tal como cuenta la CNBC en su portal.
Esto nos recuerda que el uso de los kits de qPCR como ensayo confirmatorio de la presencia de SARS-CoV-2 es de vital importancia para reducir el riesgo a eventos de contaminación.
Sumado a lo anterior, te recomendamos que trabajes en un laboratorio con áreas de trabajo diferenciadas para las áreas pre y post PCR, con un flujo de trabajo unidireccional y equipamiento exclusivo para cada área, a fin de evitar la contaminación cruzada.
Además, te recordamos que es importante tener una rutina de limpieza profunda y a conciencia de las áreas de trabajo.
Este es posiblemente uno de los problemas más críticos que uno puede enfrentar al realizar un RT-qPCR eficiente y reproducible.
Dado que el RNA es una molécula altamente susceptible a la acción de las RNasas, las muestras deben manejarse con mucho cuidado antes y después de la extracción.
El RNA degradado o contaminado afecta negativamente la eficiencia y rendimiento de la reacción, incluso puede inhibirla totalmente.
Pipetas, puntas, tubos, y todo el material involucrado en la manipulación de la muestra pueden ser foco de RNAsas y deben estar extremadamente limpios para utilizarlos con el propósito de aislar RNA.
Asegúrate de trabajar con muestras de RNA óptimas realizando un control de calidad del RNA extraído.
Una opción es determinarlo mediante espectrofotometría. Además de la concentración, fíjate en la relación de absorbancia entre 260 y 280 nm (A260/A280). Esta relación debe estar en el rango de 1.8-2.0. Si es inferior, puede sugerir la contaminación de la muestra, producto de un proceso de extracción poco eficaz.
Si la calidad de RNA es esencial para el ensayo de qPCR, el uso de un control de extracción también lo es. La extracción deficiente puede arrojar un falso negativo como resultado de una muestra que contiene SARS-CoV-2. Para esto, el diseño del control es muy importante.
Un problema recientemente reconocido por la comunidad científica (Decker et al, 2020; Rosebrock, 2020) es que los controles amplifican el DNA genómico al igual que el RNA.
Si este es el caso, una extracción deficiente de RNA podría contener cantidades suficientes de gDNA para arrojar un resultado falso positivo para el control de extracción y reportarse un falso negativo para la determinación de SARS-CoV-2, al no haber RNA que amplificar.
Está situación es plausible dado que la molécula de DNA es intrínsecamente más estable que el RNA a pH básico (Lemire et al., 2016) y las ribonucleasas tienden a ser más recalcitrantes que las desoxirribonucleasas (Farrell, 1993).
Por lo anterior es muy importante checar que tu kit de amplificación RT-qPCR tenga un mix de sonda y primeros específicos en sus controles de extracción, que no amplifican gDNA humano.
De esta forma, evitas posibles falsos negativos, ocasionados por una extracción insuficiente, sin comprometer la sensibilidad del ensayo.
En este sentido, te conviene conocer más sobre los controles endógenos únicos de los Kits de RT-qPCR Avenire.
A continuación, te compartimos 2 figuras que representan qPCR del gen de control endógeno desde DNA genómico y RNA humano con los sets de partidores/sonda CDC (negro) y Kura RNAsa P (rojo).
Figura 1: Amplificación de estándar de DNA genómico humano (250 ng, Roche 11691112001).
Figura 2: Amplificación de RNA humano de referencia (200 ng, Agilent 740000).
Los qPCR se realizaron con el set de partidores y sonda utilizado por todos los productos de la línea de Avenire RT-qPCR COVID-19 Detection kit en un equipo ABI StepOne Plus en el canal FAM, utilizando el protocolo de los kits.
Como puedes darte cuenta, es posible reducir significativamente los diagnósticos erróneos cuidando la higiene y estructura en los procedimientos pre y post PCR, así como realizar controles de calidad a las muestras de RNA.
Finalmente, utiliza un kit de amplificación que te arroje resultados confiables. De esta manera, consigues responder a la demanda de tus clientes, proteger la salud de tu equipo y optimizar tu inversión.